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ELISA實驗中制備抗體酶結合物的常用方法
發布時間:2020-03-29   點擊次數:126次
 
  酶標記的抗原或抗體稱為結合物。抗原由于化學結構不同,可用不同的方法與酶結合。如蛋白質抗原,基本上可參考抗體酶標記的方法。ELISA制備抗體酶結合物的方法通常有以下幾種。
  1.戊二醛交聯法
  戊二醛是一種雙功能團試劑,可以使酶與蛋白質或者其他抗原的氨基通過它而偶聯。戊二醛交聯可用一步法(如連接AP),也可用二步法(如連接HRP)。舉例如下:2mg~5mg純抗體與5mgAP混合與0.1mol/LpH6.8的磷酸緩沖液1mL中,4℃下對相同緩沖液透析平衡。磁力攪拌下,緩慢加入1%戊二醛0.05mL,在室溫下放置2h。在4℃下對0.05mol/LpH8.0Tris緩沖液透析平衡,即得酶標抗體。辣根過氧化酶可溶解于50%飽和度硫酸銨中。用上法交聯后可用50%飽和度硫酸銨沉淀酶標抗體,棄去上清中游離酶。戊二醛一步法操作簡單、有效,而且重復性好。缺點是交聯時分子間的比例不嚴格,大小也不一,影響效果。制備HRP抗體結合物也可用二步法,即先將HRP與戊二醛作用,透析除去戊二醛,在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標抗體。此法的效率可高于一步法10倍左右。
  2.過碘酸鹽氧化法
  本法只用于HRP的交聯。該酶含18%碳水化合物,過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼酸氫鈉中和多余的過碘酸。酶上的醛根很活潑,可與蛋白質結合,形成摩爾比例結合的酶標結合物。有人認為此法為辣根過氧化酶交聯的有效的方法。但也有人認為由于所有試劑較為劇烈,各批實驗結果不易重復。
  按以上的方法制備的結合物一般混有未結合的酶和抗體。理論上結合物中混有游離酶不影響ELISA中最后的酶活性測定,因經過洗滌,非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原,因而減低結合到固相上的酶標抗體量。因此制備的結合物應予以純化。純化的方法較多,分離大分子混合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法操作簡單,但效果不如用SephadexG-200凝膠過濾的好。
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